Table des matières

HISTORIQUE DES ANTIBIOTIQUES

HISTORIQUE DES COLORATIONS

HISTORIQUE DES CULTURES

Toutes les méthodes de coloration utilisées pour la recherche microscopique du bacille de Koch, sont basées sur la propriété fondamentale des mycobactéries : leur acido-alcoolo-résistance.

Ces méthodes de coloration ne sont pas spécifiques de la coloration des bacilles de la tuberculose mais des mycobactéries en général. De ce fait, le résultat d’un examen direct positif devra impérativement indiquer la présence de Bacilles Acido Alcoolo Résistants (BAAR) et non de bacilles tuberculeux.

La richesse en lipides des mycobactéries rend peu efficaces les colorants habituels, obligeant à recourir à des techniques particulières pour les colorer.

Pour une lecture en lumière blanche :

1882 (mars) 

Coloration initiale de Koch sur des coupes d’organes tuberculeux, par l’action prolongée du bleu de méthylène potassique pendant 24 heures à température ambiante (cette durée pouvait être réduite à une heure en plaçant la lame à 40°C), puis contre coloration au brun Bismark. Les bacilles apparaissaient colorés en bleu sur fond brun. Koch remarqua que seuls les bacilles de la lèpre présentaient les mêmes caractères tinctoriaux, les autres bactéries prenant la coloration brune de la vésuvine. Les trois facteurs importants pour la coloration des bacilles acido-alcoolo-résistants se trouvent déjà dans cette description :

• Association au colorant d’un mordant (ici la potasse). Utilisation de la chaleur, permettant de raccourcir le temps de coloration.
   
• Utilisation d’un contre colorant (ici le brun Bismark).
  (The history of the Ziehl Neelsen stain. Tubercle, 1970, 51, 196-206 : Bishop P., Neumann G.)

1882 (juin)

Ehrlich recommande l'emploi de la fuchsine, avec comme mordant l'aniline.. Les bacilles tuberculeux conservent la coloration rouge donnée par la fuchsine après décoloration de la préparation par l’acide nitrique dilué au tiers. Ainsi il met en évidence une propriété essentielle des bacilles tuberculeux : leur acido-résistance. Il conseille d’effectuer une contre coloration bleue du fond de la préparation.

1882 (août)

Ziehl remplace l’aniline par le phénol et utilise cette coloration pour le diagnostic de la tuberculose.

1882 (octobre)

Rindfleish préconise de chauffer la solution colorante.

1883

Neelsen apporte les dernières modifications et établit la formule du colorant (fuchsine : 1 g - acide phénique à 5% : 100 g - alcool : 10 g). Il conseille de réaliser : la coloration à chaud, la décoloration par l’acide sulfurique dilué au quart et l’utilisation du bleu de méthylène pour recolorer le fond de la préparation.
Le principe de cette méthode pour la coloration des mycobactéries peut être résumé en trois étapes :

1. coloration des bacilles par la fuchsine phéniquée,décoloration du fond de la préparation par l’action d’un acide dilué,
    
2. recoloration du fond (bleu de méthylène) permettant de mieux faire ressortir la teinte rouge des bacilles acido-alcoolo-résistants.

1946

Hallberg décrit une méthode où les bacilles sont colorés par un phényl-méthane : le bleu de nuit et décoloré par une solution d’alcool chlorhydrique. (New method for staining tubercle bacilli applicable also to micro-organisms of leprosy and other acid-fast germs. Act. Med. Scand. , 1946, suppl. 180, 1-37).

1951

Tison apporte des modifications à la technique d’Hallberg, permettant à ceux qui sont daltoniens de pouvoir observer en lumière ordinaire les bacilles bleus (B.A.A.R) sur un fond jaune. (Coloration de Hallberg modifiée pour la mise en évidence du bacille tuberculeux. Ann. Inst. Pasteur, 1951, 80 (1), 207-210. Et : Nouvelle coloration du bacille de Koch. Sem. Hôp. Paris, 1951, 20, 852).

1962

Tan Thiam Hok décrit une technique de coloration simplifiée (Amer. Rev. Resp. Dis., 1962, 85, 753-754), qui utilise successivement les solutions de Kinhyoun ( Amer. J. Pub. Hit. , 1915, 5, 867-870) et de Fraenkel Gabbet (Masson et Cie. Ed. 1936, page 16). La première à base de fuchsine donne au bacille sa coloration, la seconde permet la décoloration et la recoloration simultanée du fond par une solution saturée de bleu de méthylène dans
l’acide - alcool.
L’avantage de cette technique réside dans la rapidité de son exécution, cependant les bacilles sont pâles et la coloration manque de contraste.

1963

Devulder modifie la technique de Tan Thiam Hok en augmentant le temps de contact des colorants. Il obtient une coloration plus nette. Par rapport à la coloration de Ziehl-Neelsen, les bacilles ainsi colorés apparaissent moins foncés, mais leur morphologie est plus fine et leurs granulations plus marquées.

Pour une lecture par fluorescence :

1937

Hageman décrit les propriétés tinctoriales de l'auramine. L'auramine permet de mettre en évidence l'acido-alcoolo-résistance des mycobactéries au même titre que la fuchsine. Les techniques sont nombreuses. Les variations portent sur la préparation des colorants, leur temps d'action, la durée de la décoloration ou sur les colorants d'extinction.

1957

Degommier décrit une nouvelle technique de coloration des bacilles tuberculeux pour la recherche en fluorescence (Ann. Inst. Pasteur, 1957, 92, 692-694 et 1959, 96, 723).

 Quelques règles pour l'examen direct :

• L'étalement doit s'effectuer uniquement sur des lames neuves et dégraissées.
   
• Prélever avec une anse de platine rigide préalablement stérilisée à la flamme et refroidie : une parcelle purulente, hémorragique ou à défaut muqueuse.
  Le résultat de examen direct dépend du choix de cette parcelle.
   
• L'étalement ne doit jamais se faire par écrasement entre 2 lames car la projection de gouttelettes contrôlée photographiquement par Dekking, serait dangereuse pour le manipulateur.
  (Tison F., Audrin J., recherche, isolement et étude du bacille tuberculeux : Masson et Cie, édit. 1956).
   
• L'étalement doit toujours s'effectuer avec le fil de platine qui, par un mouvement de vas et vient dissociera les éléments en les disposant selon un rectangle limité à 2 mm environ des côtés de la lame et 1 cm de ses extrémités, afin d'obtenir un film uniforme, régulier en couche mince.
   
• Laisser sécher l'étalement à l'air : ne jamais le sécher à la flamme, ce qui risquerait d'entraîner une coagulation brutale.
   
• Une fois sec, l'étalement sera fixé par un ou deux passages rapides dans la flamme (étalement au-dessus en "écrasant" la flamme).
  
   

Pour éviter le transfert de bacilles d'une lame à l'autre :

1. Ne pas utiliser de cuves à coloration qui permettent la coloration simultanée de plusieurs lames, mais placer les lames sur un support en verre et les recouvrir avec le colorant.
    
2. Après coloration, ne jamais utiliser de papier buvard pour sécher les lames. Laisser sécher à l'air ou dans une étuve.
    
3. Pour l'examen microscopique avec l'objectif à immersion  : déposer la goutte d'huile en évitant soigneusement de toucher la lame (risques de transport de bacilles sur les lames suivantes).

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