Table des matières

HISTORIQUE DES ANTIBIOTIQUES

HISTORIQUE DES COLORATIONS

HISTORIQUE DES CULTURES

Glossaire

HISTORIQUE DES CULTURES

1. Homogénéisation - fluidification pour un examen direct

Le but de cette méthode est d'augmenter la sensibilité de l'examen direct. Cette technique consiste à faire digérer le produit biologique par des substances chimiques ou enzymatiques fluidifiantes. Les mycobactéries résistent assez bien à ce traitement grâce à leur paroi riche en lipides. Ces substances fluidifiantes seront éliminées après centrifugation. En effet certains prélèvements peuvent être concentrés par simple centrifugation (urines, liquides de ponction …) ; mais pour les expectorations, cette méthode permet de libérer des parcelles muqueuses ou muco-purulentes les bacilles qui peuvent éventuellement être présents.
De nombreuses méthodes ont été proposées :

L'emploi de la soude est préconisé dans de nombreuses techniques. Par exemple la méthode décrite par Besançon et Philibert. (Traité de l'examen des crachats. Masson édit., 1913, 1 vol., 412).

Calmette (L'infection bacillaire et la tuberculose. Masson 1920, 1936), utilisera les travaux de Lannoise et Girard (Nouvelle méthode de recherche du bacille de la tuberculose dans les crachats. Presse Méd., 1900, LVI, 245-246) et les travaux de Uhlenhut et Xylander (Untersuchungen uber antiformin. Arb. K. Gesund., 1909, 32, fasc. 1, 158), pour conseiller soit l'emploi de l'eau de javel, soit celui d'un mélange d'hypochlorite de chaux et lessive de soude (l'antiformine).

Stengler, propose d'utiliser la pancréatine à pH alcalin pour digérer les crachats en 24 heures à 37° C.

Grysez et Bernard décrivent un procédé d'homogénéisation des produits tuberculeux (crachats, pus, fèces, … ) par la bile de bœuf (C.R. Soc. Biol., 1920, 83, 1506).

Venot et Moreau mettent au point une technique pour la recherche des mycobactéries dans les selles (Recherche du bacille de Koch dans les fèces. Rev. Tub., 1922, 3, 296).

2. Homogénéisation - décontamination pour une culture
(et possibilité d'utiliser le culot fluidifié pour l'examen direct)

L'isolement d'une mycobactérie à partir d'un prélèvement polymicrobien nécessite d'associer :

Un procédé d'homogénéisation pour liquéfier le mucus et mettre les germes à éliminer en contact avec le décontaminant. Après une centrifugation, cette fluidification permettra aussi de réduire le volume du prélèvement.
Un procédé de décontamination pour le débarrasser de la flore d'accompagnement qui gênerait sa culture, en ménageant toute fois la viabilité des mycobactéries.

Spengler préconise l'emploi des antiseptiques en vapeur dont la méthode au formol.
(Deutsch. Med. Woch., 1895, 21, 244).

Piatkowski fait agir quelques gouttes de formol directement sur le prélèvement.
(Deut. Med. Woch., 1904, 30, 878).

Uhlenhut fait agir sur le crachat pendant une à deux heures en agitant de temps en temps, un volume égal d'antiformine à 30%. (Arb. K. Gesund., 1909, 32, fasc 1, 158).

Petroff facilite la mise en évidence du bacille tuberculeux en culture avec sa technique à la soude.
(Bull. Johns Hopkins Hosp. 1915, 276-279 et J. Experim. Med., 1915, 21, 38-42).

Lowenstein et Sumiyoshi traitent les crachats avec de l'acide sulfurique à 15% pendant 15 minutes et ensemencent, après centrifugation le culot lavé à l'eau physiologique.

Hohn utilise l'acide sulfurique à 10% pendant 20 minutes et ensemence le culot sans neutralisation ni lavage.
(Zent. für Bakt. Abt I. 1926, 98, 460-477).

En 1932, Saenz et Costil font agir sur le crachat une quantité égale d'acide sulfurique à 15% et neutralisent avec de la soude à 30% en présence de tournesol, jusqu'à l'obtention d'une teinte lilas.
(Masson Ed. Paris, 1936. Diagnostic bactériologique de la tuberculose).

Corper et Uyei utilisent l'acide oxalique à la place de l'acide sulfurique. (Amer. J. Clin. Path., 1931, 1, 135).

Mac Nabb préconise l'acide chlorhydrique à 3%. (Am. J. publ. Health, 1936, 26, 619-624).

Quisno décrit une méthode au chlorure de cétylpyridinium. (J. Bact., 1946, 52, 111-117).

Corper et Stoner emploient le phosphate trisodique à 10%. (J. Lab. Clin. Med., 1946, 31, 1364-1371).

Goldie préfère utiliser le carbonate d'ammonium. (Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1947, 65, 210-212).

Abbott montre que l'addition de pénicilline au culot d'ensemencement d'un crachat réduit le nombre des contaminations sans inhiber la culture du bacille tuberculeux. (Am. J. publ. Health, 1951, 41, 287-291).

En 1951, Tison modifie la méthode de Petroff. Il augmentera la sensibilité de cette technique en utilisant, comme neutralisant : l'acide phosphorique. (Elimination des germes banaux dans les crachats destinés à la culture du bacille de Koch. Application et perfectionnements. Ann. Inst. Pasteur, 1951, 80, 659-664).

En 1954, Tison utilise le Teepol dilué au quart. Cette substance possède une action bactéricide sur les pyogènes. Il obtient une bonne technique d'homogénéisation en associant le Teepol et la soude, car le pouvoir fluidifiant du teepol employé seul était médiocre. (Nouveau procédé d'isolement du bacille tuberculeux dans les crachats. Usage du Teepol dilué. Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, 735-736).

En 1956, Patterson emploie le zéphiran (chlorure de benzalkonium).
(The use of zephiran in the isolation of mycobacterium tuberculosis. Amer. Rev. Tub., 1956, 74, 284-288).

En raison des variations dans la composition chimique du teepol selon les pays ou les lots de fabrication, en 1961, Tacquet et Tison modifient cette technique et proposent la méthode au laurylsulfate de sodium associé à la soude. Dans la composition de la solution neutralisante, ils remplacent l'acide sulfurique par l'acide phosphorique et citent trois avantages :

La plus grande stabilité de l'acide phosphorique à la chaleur, permet l'autoclavage à 120°C de la solution neutralisante.
Le risque de formation de dérivés sulfonés toxiques pour les mycobactéries est écarté.
Le sulfate de sodium formé lors de la neutralisation est remplacé par le phosphate, mieux toléré par les mycobactéries.
(Nouvelle technique d'isolement des mycobactéries par le laurylsulfate de sodium. Ann. Inst. Pasteur, 1961, 100, 676-680).

En 1963, Kubica décrit sa technique dans laquelle il utilise la N-acétylcystéine qui se révèle un excellent agent fluidifiant et dénuée de toute action bactéricide. La décontamination du produit biologique est obtenue par l'hydroxyde de sodium à 4 % (N-acétylcystéine - soude).
(Amer. Rev. Resp. Dis., 1963, 87, 775-779 et Amer. Rev. Resp. Dis., 1964, 89, 284-286).

En 1966, Krasnow reprend le même agent mucolytique mais préfère le chlorure de benzalkonium (zéphiran) pour la décontamination du prélèvement.
(Am. J. Clin. Path., 1966, 45, 352-355).

Shah remplace la N-acétylcystéine par le dithiothréitol. Ce produit provoque une meilleure mucolyse.
(Amer. Rev. Resp. Dis., 1966, 94, 454).

Sula préconise une technique de décontamination à l'acide chlorhydrique à 10 % avec une neutralisation par la soude. (Bull. Org. Mond. Santé, 1968, 39, 647-655).

En 1987, Peres, Gevaudan, Gulian et de Micco proposent l'utilisation de la chlorhexidine comme méthode de traitement des produits pathologiques en vue de l'isolement des mycobactéries.
(Rev. française lab., 1988, 173, 67-74).

La conclusion de Tison et Carbonnelle. (Recherche, isolement et étude du bacille tuberculeux et des autres mycobactéries en pratique courante. Editions Crouan et Roques. 1972).

" D'après les travaux de Tison et Loze (1), de Krasnow (2), de Shah (3) portant sur un petit nombre de prélèvements, il paraît difficile de choisir entre deux procédés de fluidification - décontamination :
la méthode au laurylsulfate de sodium - soude (Tacquet-Tison) et celle à la N-acétylcystéine zéphiran (Krasnow).
Mais des études portant sur l'ensemencement d'un grand nombre de prélèvements contaminés ont été réalisées par : Meissner (4), Tison (5), Sula (6), Tacquet et Tison (7), Langerova et Tacquet (8).
Tous reconnaissent la supériorité de la technique au laurylsulfate de sodium - soude. La qualité finale du culot est supérieure à celle obtenue avec la N-acétylcystéine zéphiran. Ce produit est un excellent agent mucolytique mais il est dénué d'action fluidifiante sur les amas de pus qui demeurent intacts.
Ceci aura un double inconvénient :

Les bacilles contenus dans ces parcelles de pus ne seront pas libérés, ce qui provoquera une diminution de la densité des cultures.
L'action décontaminante du zéphiran ne pouvant s'exercer en profondeur, on observera un nombre plus élevé de cultures contaminées.
Ces raisons ont amené Tison et Carbonnelle à choisir et conseiller en pratique courante l'utilisation de la technique au laurylsulfate - soude, à condition d'employer des milieux solides à l'œuf ou des milieux liquides enrichis de lécithine. Tacquet et Tison (9) ont montré que cette substance est nécessaire à la neutralisation des résidus de détergent doués d'une action inhibitrice sur la culture des mycobactéries. "

3. Bibliographie

(1) Tison, Loze : " L'isolement du bacille de koch dans les crachats par les détergents. "
Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, 445-449.

(2) Krasnow, Wayne : " The mortality rate of tubercle bacilli in various digestion systems. "
Am. J. Clin. Path., 1966, 45, 352-355.

(3) Shah, Dye : " Use of dithiothreitol to replace N-acetyl-cystein for routine sputum digestion-decontamination for the culture of mycobacteria. "
Amer. Rev. Resp. Dis., 1966, 94, 454.

(4) Meissner, Tunchan : Beitr. Klim. Tuber., 1962, 126, 65-83.

(5) Tison : " Nouveau procédé d'isolement du bacille tuberculeux dans les crachats. Usage du teepol dilué. " Ann. Inst. Pasteur, 1954, 87, 735-736.

(6) Sula : " Comparative trials with different decontaminating agents for growing mycobacterium tuberculosis from sputum specimens. "
Bull. Org. Mond. Santé, 1968, 39, 647-655.

(7) Tacquet, Tison : " Nouvelle technique d'isolement des mycobactéries par le lauryl sulfate de sodium. "
Ann. Inst. Pasteur, 1961, 100, 676-680.

(8) Langerova, Tacquet : " Comparaison de différentes méthodes d'homogénéisation et de purification des produits pathologiques en fonction du milieu de culture solide ou liquide. "
Bull. Org. Mond. Santé, 1968, 39, 647-655.

(9) Tacquet, Tison, Martin : " Etude de différents procédés d'épuration des produits pathologiques et des milieux de culture pour l'isolement des mycobactéries. Comparaison entre les milieux de lowenstein - jensen et de coletsos. "
Ann. Inst. Pasteur Lille, 1962, 13, 57-76.

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