Etude de la sensibilité des mycobactéries aux antibiotiques

En 1944, les premières études de sensibilité in vitro de M. tuberculosis ont été effectuées sur différents antiseptiques en utilisant la méthode de culture sur lame mise au point par Pryce. Aujourd'hui, de nombreuses méthodes permettent l'étude phénotypique de la sensibilité aux antituberculeux des souches du complexe tuberculosis.

Pour les mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis, un antibiogramme sera systématiquement réalisé en testant les antibiotiques de première ligne (ou première intention). En cas de mono résistance à l’isoniazide, la sensibilité à une fluoroquinolone pourra être testée (antibiogramme MGIT ou Middlebrook 7H10, 7H11).

Définition d'une tuberculose multirésistante (MDR-TB) : souche du complexe tuberculosis présentant une résistance à la fois à l'isoniazide et à la rifampicine. MDR, de l'anglais multi-drug resistant.
Dans le cas d'une résistance à l’isoniazide et à la rifampicine (souche multirésistante), on testera la sensibilité de la souche aux antibiotiques de seconde ligne sur un milieu liquide et/ou solide (amikacine/kanamycine, capréomycine, ofloxacine/ciprofloxacine, éthionamide/prothionamide, rifabutine, cyclosérine, PAS).

La résistance à la rifampicine et à l’isoniazide sera vérifiée en recherchant les mutations des gènes impliqués dans ces résistances : rpoB pour la rifampicine, katG et inhA pour l’isoniazide (voir techniques de biologie moléculaire : gènes de résistance).

Les antibiotiques de deuxième ligne (ou seconde intention) seront testés :

• si une souche multirésistante est détectée (MDR).
• Si les cultures demeurent positives après 3 mois de traitement.
• Ou, lorsqu'une souche est à nouveau isolée chez un patient ayant déjà reçu un traitement antituberculeux (rechute).

Définition d'une tuberculose ultra-résistante (XDR-TB) : souche du complexe tuberculosis présentant une résistance non seulement à l'isoniazide + rifampicine (MDR); mais aussi à au moins un antibiotique de type fluoroquinolone (ofloxacine, ciprofloxacine) et une résistance à un des trois antituberculeux de deuxième ligne : capréomycine, kanamycine ou amikacine (aminoglycosides). XDR, de l'anglais extensively drug-resistant.

1. Antituberculeux : dates de leur découverte
    
2. Concentration critique en fonction des milieux utilisés
    

La méthode des proportions : antibiogramme sur des milieux solides

Pour mesurer la sensibilité aux antituberculeux, la méthode des proportions est habituellement effectuée sur un milieu de culture solide. Cette méthode de référence décrite en 1961 par Canetti, Rist et Grosset consiste à ensemencer une quantité connue d'une souche de M. tuberculosis sur des milieux de culture : Löwenstein-Jensen, Middlebrook 7H10 ou 7H11. On ensemence plusieurs dilutions d'une suspension bacillaire sur des milieux de culture sans antibiotique (témoins) et des milieux  avec l'antibiotique incorporé à une concentration définie appelée concentration critique. La concentration critique est définie pour chaque antibiotique en fonction du milieu utilisé. Avec cette technique, les résultats de l'antibiogramme sont obtenus après 3 à 6 semaines d'incubation.
Ces milieux peuvent être ensemencés :
soit directement à partir d'un crachat mais préalablement traité par une technique de fluidification et décontamination (méthode directe). Ou à partir d'une souche provenant de prélèvements d'origines diverses mais préalablement isolée sur milieu de Löwenstein-Jensen (méthode indirecte).

3. Antibiogramme : méthode indirecte (Löwenstein-Jensen)
    
4. Antibiogramme : méthode directe (Löwenstein-Jensen)
    
5. Antibiogramme : méthode indirecte(Middlebrook 7H11)
    

Antibiogramme en milieu liquide

En 1970, Bretey décrit une nouvelle technique d'antibiogramme en milieu liquide à partir d'un milieu solide pour les souches appartenant au complexe tuberculosis. Avec cette méthode, le résultat de l'antibiogramme  était obtenu en moins de 12 jours ( milieu youmans).

Publication 1982 (PDF)

 

Au début des années 1980, le Bactec 460-TB a permis d'accélérer la détection des cultures de M. tuberculosis. La croissance du bacille de la tuberculose dans un milieu liquide Middlebrook 7H12 enrichi en acide palmitique marqué au ¹⁴C s'accompagne d'une production de ¹⁴CO₂ qui était mesuré par le Bactec 460-TB. La sensibilité des isolats aux antituberculeux  était déterminée en comparant la croissance dans des flacons témoins sans antibiotique à la croissance dans les flacons contenant l'antibiotique. Des résultats concordants étaient obtenus avec la méthode des proportions, mais avec un gain de temps de l'ordre de 15 jours.

Aujourd'hui, le système Bactec MGIT en lecture manuelle ou automatisée permet de réduire le délai d'isolement des mycobactéries. Il permet également la réalisation de l'antibiogramme pour les mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis. Ce système offre plusieurs avantages par rapport au Bactec 460TB : le tube MGIT évite l'utilisation d'aiguilles; de produits radioactifs et avec le Bactec MGIT 960, une mesure automatisée de la croissance bactérienne est effectuée toutes les heures.

L'automate VersaTREK (TREK Diagnostics Systems) permet la culture  des mycobactéries  et l'antibiogramme de M. tuberculosis. Avec ce système 5 antituberculeux peuvent être testés (streptomycine, isoniazide, rifampicine, éthambutol et pyrazinamide).
En France cet automate est commercialisé par Biocentric.

 

6. Antibiogramme MGIT: méthode manuelle
   Pour tester les antibiotiques de première ligne (SIRE) ou les antibiotiques de deuxième ligne.
    

7. Antibiogramme MGIT : automate Bactec MGIT 960
   Pour  tester les antibiotiques de première ligne (SIRE et PZA) ou les antibiotiques de deuxième ligne.
    

Autres méthodes

8. Antibiogramme par diffusion : méthode des disques sur milieux de Löwenstein-Jensen
    
9. Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) : méthode Etest
   

Cette méthode est généralement utilisée pour la mesure des CMI aux antibiotiques de certaines mycobactéries atypiques. Cette technique peut être utilisée pour M. tuberculosis.

 

Une méthode basée sur la réduction des nitrates (NRA) a été décrite.
Elle consiste à incorporer au milieu de Löwenstein-Jensen, 1 mg/ml de nitrate de potassium et les mêmes concentrations d'antibiotiques qui sont utilisées pour la méthode des proportions.
Rapid and Inexpensive Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis with a Nitrate Reductase Assay. Ängeby et al.
Journal of Clinical Microbiology, Feb. 2002, p. 553–55.

 

Une autre méthode en milieu liquide contenant les antituberculeux, permet de détecter au microscope la formation de cordes qui sont caractéristiques de la croissance de M. tuberculosis. The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis.
Journal of Visualized Experiments, 2008 Aug 11;(17) Mark F Brady and coll. (MODS : Microscopic Observation Drug Susceptibility).