3. Méthode
indirecte (Löwenstein-Jensen)
La méthode indirecte est réalisée à partir d'une souche déjà
isolée sur un milieu solide (Löwenstein-Jensen ou Coletsos).
Matériel stérile :
- Flacon contenant environ 100 ml d'eau distillée.
- 1 tube à vis contenant environ 10 ml d'eau distillée.
- Tubes à vis de 18 x 145 mm.
- Pipettes graduées.
- Pipettes pasteur.
- Erlenmeyer de 125 ml et un tube à vis contenant une
vingtaine de billes de verre.
Equipement recommandé :
- Hotte de sécurité.
- Matériel de pipetage motorisé type Pipetus.
- Poire à pipeter de 1 ml (pour pipetage avec pipettes pasteur).
- Anse de platine plate (spatule).
- Stérilisateur type Bacti-Cinerator pour stériliser l'anse
de platine.
- Vortex.
- Témoin opacimétrique : tube étalon contenant une suspension BCG
à 1mg/ml.
Technique
- Identifier 7 tubes stériles : 100
(pur) puis 10-1 à 10-6.
- Transférer les billes stériles dans l'erlenmeyer.
- Dans les tubes notés 10-1
à 10-6, ajouter 9 ml d'eau distillée
stérile.
- Ajouter 1 ml d'eau distillée stérile dans l'erlenmeyer.
- Avec une anse de platine plate, prélever à la surface
d'un milieu solide un grand nombre de colonies c'est à dire une anse de
platine bien pleine (ou 2 anses, l'équivalent d'environ 5 mg de colonies).
- Déposer les colonies dans l'erlenmeyer.
- Agiter l'erlenmeyer pendant 5 minutes.
- Mettre une pipette pasteur sur la poire. Prélever environ
1 ml dans le tube d'eau distillée stérile et l'ajouter dans
l'erlenmeyer. Agiter 10 à 15 secondes.
- Transférer la suspension de l'erlenmeyer dans le tube
noté 100
(pur).
- Comparer l'opacité à l' œil nu. Ajuster la concentration
de cette suspension en ajoutant de l'eau distillée jusqu'à l'obtention d'une
opacité équivalente à celle du tube témoin contenant la suspension BCG à 1
mg/ml.
A partir de cette suspension, préparer les dilutions de 10-1
à 10-6.
- Dilution 10-1 (0,1
mg) : ajouter 1 ml de la suspension 100
(1 mg/ml) à 9 ml d'eau distillée stérile. Mélanger à l'aide d'un vortex.
- Dilution 10-2 (0,01
mg) : ajouter 1 ml de la suspension 10-1
à 9 ml d'eau distillée stérile. Mélanger à l'aide d'un vortex.
- Procéder de cette façon pour réaliser successivement les
dilutions et obtenir la dilution 10-6
(0,000001 mg).
Ensemencement des différents milieux de Löwenstein-Jensen.
- Ensemencer 0,2 ml de la dilution 10-6
sur 2 milieux de Löwenstein-Jensen (témoins).
- Ensemencer 0,2 ml de la dilution 10-5
sur 2 milieux de Löwenstein-Jensen et 1 tube par concentration
d'antibiotique.
- Ensemencer 0,2 ml de la dilution 10-4
sur 2 milieux de Löwenstein-Jensen.
- Ensemencer 0,2 ml de la dilution 10-3
sur 2 milieux de Löwenstein-Jensen et 1 tube par concentration
d'antibiotique.
- Ensemencer 0,2 ml de la dilution 10-1
sur 2 milieux de Löwenstein-Jensen et 1 tube par concentration
d'antibiotique.
- Répartir l'inoculum sur la pente de chaque milieu. Le bouchon
des tubes doit être dévissé (laisser les bouchons à vis lâches pour
permettre l'évaporation du liquide).
- Incuber à 37° C en position horizontale.
- Revisser les bouchons hermétiquement lorsque le liquide
s'est évaporé (généralement après 5 à 7 jours d'incubation).
Les colonies des tuberculeux prennent un aspect typique si
le milieu est bien oxygéné et si la partie liquide de l'inoculum est bien
évaporée (tubes fermés qu'après une évaporation complète).
La lecture sera effectuée à partir du 21ème
jour ou au 28ème jour. Une deuxième et
dernière lecture sera faite au 40ème
jour.
Le nombre de colonies est soigneusement compté, quelle que
soit leur taille, sur les tubes témoins (nombre de bacilles viables) et sur
les tubes avec antibiotique (nombre de bacilles résistants).
D'après le nombre des colonies observé, on déduira la proportion de bacilles
résistants existant dans la souche étudiée. En dessous d'une certaine
proportion, dite "proportion critique", la souche est dite sensible, au-delà
elle est dite résistante.
Pour l’isoniazide (à 0,2 µg/ml), rifampicine, streptomycine, PAS et
éthambutol la souche est dite sensible lorsque la proportion de bacilles
résistants est égale ou supérieure à 1 % et pour les autres antituberculeux,
lorsqu'elle est supérieure à 10 %.
Proportion de bacilles résistants :
exemples de calcul
Comme le pyrazinamide n'est actif qu'à pH acide, pour déterminer la proportion de bacilles résistants au PZA,
le milieu acidifié avec antibiotique doit être comparé avec le milieu témoin
acidifié (pH 5,5). A ce pH, la
croissance des mycobactéries du complexe tuberculosis est parfois limitée, ce qui
peut rendre le test difficilement interprétable. Pour éviter l'absence d'une culture
sur le tube témoin à 10-5, il est
conseillé d'ensemencer ces milieux acidifiés avec les dilutions 10-4,
10-2 et 10-1.
Glossaire 
