4. Méthode directe (Löwenstein-Jensen)

La méthode directe est réalisée à partir du culot de centrifugation d'un produit biologique traité par une technique de fluidification et décontamination (laurylsulfate ou soude à 4%) à condition que ce prélèvement soit suffisamment riche en bacilles (au moins 01 BAAR/10champs). Cette méthode permet de raccourcir les délais de réponse en évitant les 3 à 4 semaines d'attente pour l'obtention de la primoculture.

Matériel stérile :

• Flacon contenant environ 100 ml d'eau distillée.
• Tubes à vis de  18 x 145 mm.
• Pipettes graduées.
• Pipettes pasteur.
• Pots coniques de 50 ml.
• Solution décontaminante et neutralisante pour traiter le prélèvement.

Equipement recommandé :

• Hotte de sécurité.
• Matériel de pipetage motorisé type Pipetus.
• Poire à pipeter de 1 ml (pour pipetage avec pipettes pasteur).
• Anse de platine.
• Stérilisateur type Bacti-Cinerator pour stériliser l'anse de platine.
• Vortex.

Technique

• A partir du culot de centrifugation d'un produit biologique préalablement décontaminé (laurylsulfate ou soude à 4%) et neutralisé, faire un étalement sur une lame.
• Colorer la lame en utilisant la technique de Ziehl-Neelsen.
• Procéder à la numération. Si le prélèvement est suffisamment riche en bacilles (au moins 1 BAAR/10champs) : préparer à partir de ce culot la dilution 10^-1 (suspension mère).
• Suspension mère à 10^-1 : ajouter 3 ml d'eau distillée stérile dans le pot conique (culot d'environ 0,3 ml + 3 ml d'eau distillée stérile = dilution 10^-1). Mélanger à l'aide d'un vortex.

A partir de cette suspension mère, d'autres dilutions seront préparées en fonction du nombre de bacilles observés à l'examen direct.

Examen direct :	Dilutions à ensemencer :	2 témoins à ensemencer avec dilutions(s) :
Moins de 1 BAAR pour 10 champs	Test non réalisé	Test non réalisé
1 à 10 BAAR pour 10 champs	10-1, 10-2 et 10-3
1 à 10 BAAR par champ	10-1, 10-3 et 10-4	10-2 et 10-5
Plus de 10 BAAR par champ	10-2, 10-4 et 10-5	10-3 et 10-6

• Dilution 10^-2 : ajouter 0,5 ml de la suspension 10^-1 à 4,5 ml d'eau distillée stérile. Mélanger à l'aide d'un vortex.
• Dilution 10^-3 : ajouter 0,5 ml de la suspension 10^-2 à 4,5 ml d'eau distillée stérile. Mélanger à l'aide d'un vortex.
• Dilution 10^-4 : ajouter 0,5 ml de la suspension 10^-3 à 4,5 ml d'eau distillée stérile. Mélanger à l'aide d'un vortex.
• Procéder de cette façon pour réaliser successivement les dilutions suivantes jusqu'à la dilution  10^-6 si nécessaire.

Ensemencement des différents milieux de Löwenstein-Jensen.

• Ensemencer chaque tube avec 0,2 ml de la dilution choisie.
• Répartir l'inoculum sur la pente du milieu. Le bouchon des tubes doit être dévissé (laisser les bouchons à vis lâches pour permettre l'évaporation du liquide).
• Incuber à 37° C en position horizontale.
• Revisser les bouchons hermétiquement lorsque le liquide s'est évaporé (généralement après 5 à 7 jours d'incubation).

Les colonies des tuberculeux prennent un aspect typique si le milieu est bien oxygéné et si la partie liquide de l'inoculum est bien évaporée (tubes fermés qu'après une évaporation complète).

La lecture sera effectuée au 28^ème jour. Une lecture définitive sera faite au 40^ème jour. 

Le nombre de colonies est soigneusement compté, quelle que soit leur taille, sur les tubes témoins (nombre de bacilles viables) et sur les tubes avec antibiotique (nombre de bacilles résistants).
D'après le nombre des colonies observé, l'on déduira la proportion de bacilles résistants existant dans la souche étudiée. En dessous d'une certaine proportion, dite "proportion critique", la souche est dite sensible, au-delà elle est dite résistante.

Pour l’isoniazide (à 0,2 µg/ml), rifampicine, streptomycine, PAS et éthambutol la souche est dite sensible lorsque la proportion de bacilles résistants est égale ou supérieure à 1 % et pour les autres antituberculeux, lorsqu'elle est supérieure à 10 %.

Proportion de bacilles résistants : exemples de calcul

Comme le pyrazinamide n'est actif qu'à pH acide, pour déterminer la proportion de bacilles résistants au PZA, le milieu acidifié avec antibiotique doit être comparé avec le milieu témoin acidifié (pH 5,5). A ce pH, la croissance des mycobactéries du complexe tuberculosis est parfois limitée, ce qui peut rendre le test difficilement interprétable. La méthode directe n'est pas conseillée pour l'étude de la sensibilité au pyrazinamide.