5. Méthode indirecte (Middlebrook 7H11)

La méthode indirecte est réalisée à partir d'une souche déjà isolée sur un milieu solide (Löwenstein-Jensen ou Coletsos). La méthode directe n'est pas possible avec ce milieu.

Matériel stérile :

Boites de culture rectangulaires à 6 cupules.
Flacon d'eau distillée.
1 tube à vis contenant environ 10 ml d'eau distillée.
Tubes à vis de 18 x 145 mm.
Pipettes graduées.
Pipettes pasteur.
Erlenmeyer de 125 ml et un tube à vis contenant une vingtaine de billes de verre.

Equipement recommandé :

Balance de précision pour la pesée des antibiotiques.
Hotte de sécurité.
Matériel de pipetage motorisé type Pipetus.
Poire à pipeter de 1 ml (pour pipetage avec pipettes pasteur).
Anse de platine plate (spatule).
Stérilisateur type Bacti-Cinerator pour stériliser l'anse de platine.
Vortex.
Témoin opacimétrique : tube étalon contenant une suspension BCG à 1mg/ml.

Technique

Identifier 7 tubes stériles : 10⁰ (pur) puis 10^-1 à 10^-6.
Transférer les billes stériles dans l'erlenmeyer.
Dans les tubes notés 10^-1 à 10^-6, ajouter 9 ml d'eau distillée stérile.
Ajouter 1 ml d'eau distillée stérile dans l'erlenmeyer.
Avec une anse de platine plate, prélever à la surface d'un milieu solide un grand nombre de colonies c'est à dire une anse de platine bien pleine (ou 2 anses, l'équivalent d'environ 5 mg de colonies).
Déposer les colonies dans l'erlenmeyer.
Agiter l'erlenmeyer pendant 5 minutes.
Mettre une pipette pasteur sur la poire. Prélever environ 1 ml dans le tube d'eau distillée stérile et l'ajouter dans l'erlenmeyer. Agiter 10 à 15 secondes.
Transférer la suspension de l'erlenmeyer dans le tube noté 10⁰ (pur).
Comparer l'opacité à l' œil nu. Ajuster la concentration de cette suspension en ajoutant de l'eau distillée jusqu'à l'obtention d'une opacité équivalente à celle du tube témoin contenant une suspension BCG à 1 mg/ml.

A partir de cette suspension, préparer les dilutions de 10^-1 à 10^-6.

Dilution 10^-1(0,1 mg) : ajouter 1 ml de la suspension 10⁰ (1 mg/ml) à 9 ml d'eau distillée stérile. Mélanger à l'aide d'un vortex.
Dilution 10^-2(0,01 mg) : ajouter 1 ml de la suspension 10^-1 à 9 ml d'eau distillée stérile. Mélanger à l'aide d'un vortex.
Procéder de cette façon pour réaliser successivement les dilutions et obtenir la dilution 10^-6 (0,000001 mg).

Ensemencement des cupules.

Ensemencer 0,1 ml de la dilution 10^-6 dans une cupule de la boite témoin.
Ensemencer 0,1 ml de la dilution 10^-5 dans chaque cupule de la boite contenant les antibiotiques et dans une cupule de la boite témoin.
Ensemencer 0,1 ml de la dilution 10^-4 dans chaque cupule de la boite contenant les antibiotiques et dans une cupule de la boite témoin.
Ensemencer 0,1 ml de la dilution 10^-3 dans une cupule de la boite témoin.
Ensemencer 0,1 ml de la dilution 10^-2 dans chaque cupule de la boite contenant les antibiotiques et dans une cupule de la boite témoin.
Ensemencer 0,1 ml de la dilution 10^-1 dans une cupule de la boite témoin.
Répartir l'inoculum sur le milieu.
Incuber les boites à 37° C.
Après 2 jours d'incubation, sceller les boites dans des sachets plastique. Pour éviter la condensation, percer les sachets avec une aiguille.

Résumé de la technique

La lecture sera effectuée à partir du 21^ème jour ou au 28^ème jour. Une deuxième et dernière lecture sera faite au 40^ème jour.

Le nombre de colonies est soigneusement compté, quelle que soit leur taille, sur le milieu témoin (nombre de bacilles viables) et sur les milieux avec antibiotique (nombre de bacilles résistants).
D'après le nombre des colonies observé, l'on déduira la proportion de bacilles résistants existant dans la souche étudiée. En dessous d'une certaine proportion, dite "proportion critique", la souche est dite sensible, au-delà elle est dite résistante.

La proportion critique est de 1% pour tous les antibiotiques.

Le calcul du pourcentage de bacilles résistants = nombre de colonies sur le milieu avec antibiotique / nombre de colonies sur le milieu témoin X 100.

Souche présentant une résistance à INH et streptomycine

Souche présentant une résistance à la rifampicine