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La richesse en lipides des mycobactéries
rend peu efficaces les colorants habituels, obligeant à
recourir à des techniques particulières pour les colorer.
La mise en
évidence de Bacilles Acido-Alcoolo-Résistants
(BAAR) dans un prélèvement, peut être réalisée grâce à 2
techniques de coloration :
la méthode de
Ziehl-Neelsen qui utilise la fuchsine et la méthode de Degommier utilisant l'auramine.
Ces méthodes de
coloration qui sont utilisées pour la recherche microscopique
du bacille de Koch, sont basées sur la propriété fondamentale
des mycobactéries : leur acido-alcoolo-résistance.
Ces méthodes de coloration ne sont pas spécifiques des bacilles de la tuberculose mais des
mycobactéries en général. De ce fait, le résultat d’un examen
direct positif devra impérativement indiquer la présence de
BAAR et non de bacilles tuberculeux.
L'examen microscopique doit être effectué avec minutie :
l'échantillon est étalé en couche mince puis fixé et ensuite coloré par la méthode de Ziehl Neelsen.
Le temps nécessaire à la bonne lecture (200 champs) d'un frottis effectué
à partir d'un prélèvement paucibacillaire
et coloré par cette méthode est de 20 minutes
environ.
La présence de BAAR à l'examen direct
signale la présence d'au moins 104 bacilles/ml dans
le produit pathologique, ce qui correspond à des lésions évoluées et contaminantes.
La coloration de
Ziehl est très importante tant du point de vue diagnostic que du point de vue épidémiologique.
Un patient présentant un examen direct positif est une source
de transmission de la tuberculose.
Il est recommandé de
classer les frottis en fonction de leur richesse en bacilles.
Cette quantification permettra aussi un suivi de l'évolution
de la maladie au cours de traitement.
Quelques règles pour l'examen direct :
-
Effectuer les
étalements uniquement sur des lames neuves et
dégraissées. Si les lames ne sont pas dégraissées, on peut :
-
les nettoyer
à l'eau chaude,
-
puis les
stocker dans un cristallisoir contenant :
1 litre d'alcool à 95° et 1 ml d'acide
sulfurique.
Avant d'utiliser ces lames dégraissées :
les essuyer avec une compresse (ou un linge propre),
les passer rapidement à la flamme.
Ainsi préparées, elles pourront être utilisées pour effectuer
un étalement qui adhèrera correctement à la lame.
-
Prélever une
parcelle purulente, hémorragique ou à défaut muqueuse avec une
anse de platine rigide préalablement stérilisée à la flamme et
refroidie.
Du choix de cette parcelle dépend du résultat de l'examen
direct.
Avec le fil de platine, l'étalement doit se faire par un
mouvement de va et vient qui dissociera les éléments en les
disposant selon un rectangle limité à 2 mm environ de chaque
côté de la lame et 1 cm de ses extrémités, afin d'obtenir un
film uniforme, régulier, en couche mince.
-
L'étalement ne
doit jamais se faire par écrasement entre 2 lames car la
projection de gouttelettes contrôlée photographiquement par
Dekking, est dangereuse pour le manipulateur.
(Tison F.,
Audrin J., recherche, isolement et étude du bacille
tuberculeux : Masson et Cie, édit. 1956).
-
Laisser sécher
l'étalement à l'air : ne jamais le sécher à la flamme, ce qui
risquerait d'entraîner une coagulation brutale.
Une fois sec, l'étalement sera fixé par un ou deux passages
rapides dans la flamme (étalement au-dessus en " écrasant " la
flamme).
Pour éviter le transfert de bacilles
d'une lame à l'autre :
-
Ne pas
utiliser de cuves à coloration qui permettent la coloration
simultanée de plusieurs lames, mais placer les lames sur un
support en verre et les recouvrir avec le colorant.
-
Après
coloration, ne jamais utiliser de papier buvard pour sécher
les lames. Laisser sécher à l'air ou dans une étuve.
-
Pour l'examen
microscopique avec un objectif à immersion : déposer la goutte
d'huile en évitant soigneusement de toucher la lame (risques
de transférer des bacilles sur les lames suivantes).
Ziehl-Neelsen
(coloration à chaud)
Cette coloration décrite par Ziehl puis
modifiée par Neelsen est spécifique des mycobactéries.
Les bacilles retiennent le colorant malgré l'action combinée
de l'acide dilué et de l'alcool. Ils apparaissent comme des
fins bâtonnets rouges (Bacilles Acido-Alcoolo-Résistants : BAAR).
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Colorations à froid :
L’avantage de ces colorations à froid réside
dans leur rapidité d'exécution. Ces techniques sont très
séduisantes, cependant les bacilles sont pâles et la
coloration manque de contraste : elles ne sont pas à
conseiller en routine.
Coloration de Kinyoun modifiée
Coloration de Tan-Thiam-Hok
Auramine
Méthode de coloration
décrite par Degommier, les bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) apparaissent en vert jaune brillants sur
un fond rouge orangé.
ANDA
Test diagnostique in vitro pour la détection des bacilles de la tuberculose dans les expectorations et autres types d'échantillons.
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Glossaire
